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研究生： 郎冠智
Kuan-Chin Lang
論文名稱： Oc4和Nanog共同抑制末端肌肉分化
Oct4 and Nanog cooperative repress terminal myogenic differentiation
指導教授： 陳盛良
Shen-Liang Chen
口試委員:
學位類別： 碩士
Master
系所名稱： 生醫理工學院 - 生命科學系
Department of Life Science
畢業學年度： 96
語文別： 中文
論文頁數： 71
中文關鍵詞： 肌肉分化 、多能性 、幹細胞
外文關鍵詞： stem cell, pluripotency, muscle differentiation
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    • 胚胎幹細胞是屬於具有多能性的幹細胞，主要是由囊胚層裡的內細胞層而
    來，而且可以分化成三個胚層和大部份的細胞類型，為了要維持幹細胞的多能性
    與自我更新需要外在的調控因子如LIF、BMP，和內在的因子如Oct4 和Nanog。
    Oct4 又稱Oct3 是屬於POU 的轉錄因子，之前的研究指出Oct4 只表現在幹細胞中。
    Nanog 為一 homoebox 的轉錄因子，在胚胎發育的時候Nanog 在內細胞層的多能
    性與細胞命運的決定中扮演著重要的腳色，我們在 C2C12 中大量表現 Oct4 和
    Nanog 後發現在細胞進行分化過程中，其肌管的數目明顯下降，其中在
    C2C12-Oct4 的穩定細胞株中其分化能力比 control 低，而在同時表現 Oct4 和
    Nanog 的穩定細胞株中，並沒有觀察到肌管的產生。在 fusion index 的數據中，
    在大量表現 Oct4 時和 control 相比下降了 60% 而且在同時表現 Oct4 和
    Nanog 時幾乎趨近於零。 在RT-PCR 的資料中我們也觀察到 MRF 基因家族在
    大量表現 Oct4 的穩定細胞株中表現量下降，而在同時表現oct4 和Nanog 時表
    現量的下降有更為增強的趨勢，在胚胎幹細胞的特異性基因的表現情況中發現在
    大量表現 Oct4 和 Nanog 的穩定細胞株中其表現量上升。Pax7 在大量表現Oct4
    的穩定細胞株中表現量下降，中胚層的marker CD34 和血液幹細胞的marker Sca1
    在C2C12-Oct4-py-Nanog 細胞株中表現量顯著的上昇。在未來的研究中我們希望
    找出Oct4 和Nanog 影響C2C12 分化的分子機制。

    Embryonic stem (ES) cells are pluripotent cell derived from the inner cell mass
    (ICM) of blastocysts and can differentiate into most cell types. To maintaine
    pluripotency and self-renewal they need extrinsic regulators, such as LIF and BMP,
    and intrinsic factors, like Oct4 and Nanog. Oct4, also know as Oct3, belong to the
    POU (pit-oct-uno) transcription factor family. Recent studies indicate that Oct4 is
    only expressed in stem cells. Nanog is a unique homoebox transcription factor and
    plays a critical role in regulating cell fate of the pluripotent ICM during embryonic
    development. We over-expressed Oct4 and Nanog in myoblasts and found that their
    myogenic differentiation was morphologically repressed. C2C12-Oct4 stable clone
    differentiated poorer than control and no myotubes was detected in cells
    overexpressing Oct4 and Nanog . The fusion index in C2C12-Oct4 was repressed by
    60% and almost not detectable in Oct4/Nanog stable clone. Using RT-PCR, we found
    MRF families were down-regulated in Oct4 stable clone as compared with control and
    their expression were repressed farther in double expression stable clone. ES cell
    marker expression was increased in double expression stable clone. Pax7 is repressed
    in C2C12-Oct4 stable clone. Mesoderm marker CD34 and hematopoietic stem cell
    marker gene Sca1 were significantly enhanced in C2C12-Oct4-py-Nanog cells. In the
    future, we like to find out the underlying molecular mechanisms by which Oct4 and
    Nanog influence C2C12 differentiation.

    摘要……………………………………………………………………………………I Abstract…………………………………………………………………………… II 目錄…………………………………………………………………………………III 圖目錄……………………………………………………………………………… Ⅴ 第一章、序論…………………………………………………………………………1 1-1 幹細胞……………………………………………………………………………1 1-2 肌肉生成…………………………………………………………………………5 1-3 研究動機與目的…………………………………………………………………6 第二章、材料與方法…………………………………………………………………8 2-1 穩定表現Oct3 WT 和 Nanog 抑制肌纖維母細胞的分化………………………8 2-1-1 細胞培養………………………………………………………………………8 2-1-2 C2C12-Oct3WT-pPyCAGIP ＆ C2C12-Oct3WT- pPyCAGIP-Nanog 穩定細胞株 的製備…………………………………………………………………………………8 2-1-3 C2C12-retro-pPyCAGIP 穩定細胞株的製備……………………………….9 2-1-4 RT-PCR …………………………………………………………………………9 2-1-5西方墨點實驗…………………………………………………………………11 2-1-6Immunohistochemistry………………………………………………………13 2-2 質體建構……………………………………………………………………… 13 2.2.1 質體建構之基本流程……………………………………………………… 13 2.2.2 載體DNA (pGL3 basic) 的製備………………………………………… 17 2-2-3 inser DNA (Myf5 promoter 和 MRF4 promoter) 的製備………………18 第三章、結果…………………………………………………………………………20 3-1 建立Oct3WT-pycag 和Oct3WT-pycag-Nanog 穩定細胞株及偵測其表現情況 ……………………………………………………………………………………… 20 3-2 觀察各個穩定細胞株的表現及分化型態…………………………………… 20 3-3 觀察各個穩定細胞株中與肌肉分化相關基因的表現情況………………… 21 3-4 PGL3-Myf5 promoter 與 PGL3-MRF4 promoter 質體建構…………………23 3-5 觀察Oct4 和Nanog 對MRFs promoter 的調控………………………………23 3-6 觀察 corepressor 對 hMyoD 和 Pax7 promoter 的調控…………………24 3-7 PMSCV-Oct3△C 與 PMSCV-Oct3 V235P 質體建構……………………………25 3-8 將Oct4 C-terminal deletion 後對 C2C12 myoblast 分化的影響………26 3-9 觀察SOX2 對C2C12 myoblast 分化的影響……………………………………26 第四章、討論…………………………………………………………………………27 4-1 Oct3WT 和Nanog 對肌肉分化的影響………………………………………… 26 4-2 Oct3WT 和Nanog 誘導內生性幹細胞因子表現……………………………… 28 IV 4-3 Oct3WT 和Nanog 對於MRFs promoter 的影響…………………………………28 第五章、參考文獻……………………………………………………………………30 附錄一 ………………………………………………………………………………55

    圖一 利用RT-PCR 個穩定細胞株中目標基因的表現量………………………… 32
    圖二 利用western blot 觀察穩定細胞株中目標蛋白質的表現…………………33
    圖三 各穩定細胞株confluent 型態………………………………………………34
    圖四 各穩定細胞株分化4 天後型態………………………………………………35
    圖五 各穩定細胞株fusion index ……………………………………………… 36
    圖六-1 利用RT-PCR 觀察各個穩定細胞株其肌肉相關基因在CMB 的表現量……39
    圖六-2 利用RT-PCR 觀察各個穩定細胞株其肌肉相關基因在MT 的表現量……42
    圖六-3 利用QPCR 分析觀察各個穩定細胞株其肌肉相關基因在MT 的表現量…45
    圖七 PGL3-myf5 promoter 和PGL3-MRF4 promoter 質體建構圖…………………46
    圖八 Oct3WT 和Nanog 對不同MRFs promoter 的調控……………………………48
    圖九 co-repressor 對 hMyoD 和 Pax7 promoter 的影響…………………… 50
    圖十 PMSCV-Oct4△C 質體建構圖…………………………………………………51
    圖十一 各個SOX2 穩定細胞株分化4 天後型態……………………………………54

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