PDCD5蛋白在Sulfolobus solfataricus 古生菌的結構與功能分析

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研究生：	許家源 Chia-Yuan Hsu
論文名稱：	PDCD5蛋白在Sulfolobus solfataricus 古生菌的結構與功能分析 Structural & Functional Activity analysis of Programmed Cell Death 5 from the Hyperthermophile Sulfolobus solfataricus
指導教授：	陳青諭 Chin-Yu Chen
口試委員:
學位類別：	碩士 Master
系所名稱：	生醫理工學院 - 生命科學系 Department of Life Science
論文出版年：	2016
畢業學年度：	104
語文別：	中文
論文頁數：	98
中文關鍵詞：	硫化屬葉菌、細胞凋亡、第五型程序凋亡訊息蛋白、X光繞射結晶學、蛋白質結構建構
外文關鍵詞：	Sulfolobus solfataricus, Programmed Cell Death, Sso-PDCD5 protein, X-ray crystallization, Structural Building
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本研究是為了了解以古生菌Sulfolobus solfataricus內的DNA結合蛋白PDCD5中的結構進而可了解DNA結合蛋白PDCD5在古生菌中扮演的角色。古生菌Sulfolobus solfataricus屬於Sulfolobaceae科底下分支的一種古生菌，第一次被發現於義大利拿坡里附近的火山島伊斯基亞島是第一批被完成解序的硫化嗜熱古生菌。
PDCD5蛋白質是個最早被發現在人類體內細胞用來上調節的細胞凋亡蛋白。PDCD5蛋白質可從細胞質向細胞核迅速的通過並與Tip60蛋白結合於DNA造成乙醯化，進而傳遞細胞凋亡訊息，其重要性為調節第五型賴氨酸乙酰轉化酶抑制其蛋白酶體相關的降解（參與轉錄、DNA損傷反應和細胞週期控制蛋白）。我們從KEGG數據分析庫確定了SSO0352基因為PDCD5蛋白在古生菌Sulfolobus solfataricus的同源基因，由於目前在古生菌Sulfolobus solfataricus的功能仍然還是未知，為了研究是否有相似的作用及結構。我們表現在質體pET-21a上和找到適合生產PDCD5蛋白質的方法，並表現於大腸桿菌(RIL)菌株，找到其純化條件。利用陽離子交換樹脂和膠體交換法純化出蛋白並使用X-ray繞射與單重原子異常散射（SAD）得知PDCD5蛋白的結構。Sso-PDCD5晶體在X-ray的繞射數據為Space group=C2, a = 100.34 Å, b = 39.71 Å, c = 77.57 Å, α= γ= 90∘, β = 125.15∘的晶胞大小與2.30 Å的解析度。對於解決相位問題，利用點突變蛋白質SsoPDCD5-L45M（L45M）的繞射數據來解決。SeMet-L45M晶體在X-ray的繞射數據為的Space group=C2, a = 109.31 Å, b = 41.03 Å, c = 77.68 Å, α= γ= 90∘, β = 129.51∘的晶胞大小，解析度在2.13 Å。 SsoPDCD5總共具有四個α-螺旋其中三個在N端為低靈活性並可被解析的α-螺旋和另一個是在C端尾部高靈活可動的未解的α-螺旋。 C端的色氨酸(tryptophan)透過結合20bp的雙鏈DNA的熒光光譜實驗表示PDCD5的C端11個胺基酸可能與DNA相互作用。

The Programmed Cell Death 5 (PDCD5) is an important signal protein of apoptosis pathway in human. It can interact with Tip60 to induce cell arrest when DNA over damage, and binds with p53 protein from ubiquitination. In previous research, it is known there are triple-helix bundle and two dissociated N-terminal regions in human PDCD5 protein. However, the study of PDCD5 remains unclear in hyperthermophile archaea. Here we identify a PDCD5 homolog, Sso-0352 (SsoPDCD5), in Sulfolobus solfataricus. To explore the differences of PDCD5 homologous protein from S. solfataricus and other species, we express and crystallize the protein S. solfataricus and determine the structure by Single Wavelength Diffraction (SAD) method. The native Sso-PDCD5 crystal appears to the space group C2 with unit cell magnitude of a = 100.34 Å, b = 39.71 Å, c = 77.57 Å, α= γ= 90∘, β = 125.15∘ with 2.30 Å resolution. For the phasing, the structure of single mutant protein SsoPDCD5-L45M (L45M) is also solved as well. The space group of L45M is C2 with unit cell magnitude of a = 109.31 Å, b = 41.03 Å, c = 77.68 Å, α= γ= 90∘, β = 129.51∘with 2.13 Å resolution for SeMet-L45M crystal. SsoPDCD5 has a compact core of low flexibility with four alpha-helices at N-terminal region and a flexible unstructured C-terminal tail. The C-terminal tryptophan can be quenched by 20bp double strand DNA. It indicates PDCD5 may interact with DNA with the C-terminal tail.

中文摘要 ……………………………………………………………………I
Abstract ………………………………………………………………….....III
誌謝 ……………………………………………………………………….IV
目錄 ………………………………………………………………………...V
圖目錄 ………………………………………………………………….....IX
表目錄 ……………………………………………………………………XII
縮寫檢索表 ……………………………………………………………...XIII
第一章    緒論 ………………………………………………………………………... 1
1.1    Programmed Cell Death protein 5生成路徑與功能解析………..........................1
      1.1.1人類PDCD5………………………………….……………………………....1
      1.1.2古生菌PDCD5………………………………………………………….……2
1.2細胞程序性死亡(Programmed Cell Death)…………………………….………..    4
1.3古生菌(Archaea)……………………………………………....................5
1.3.1古生菌的分類………………………………………………..………….….5
1.3.2 硫化屬葉菌(Sulfolobus solfataricus)……………………………………5
1.4 結構學概論…………………………………………………………..…………...7
1.4.1 結構學分類…………………………………………………..…………    …7
1.4.2 蛋白質晶體…………………………………………………..…………    …7
1.4.3 布拉格定律(Bragg’s Law)……………………………………..……….    ....8
1.4.4 蛋白質繞射……………………………………………………..………    …9
1.4.5 相位角…………………………………………………………....……    …11
1.5 研究目的及動機…………………………………………………............    ....13

第二章    材料與方法………………………………………………………….….…14
2.1 實驗架構設計…………………………………………………………….….    ….14
2.2 在pET-21a載體建構目標基因Sso-PDCD5序列…………………    ……….…15
      2.2.1 從硫化葉菌全基因體萃取目標基因Sso-PDCD5序列(PCR方法)….....15
         2.2.1.1 Sso-PDCD5可藉由引子改善限制酶自切…...……….18
         2.2.1.2 聚合酶鏈鎖反應(Polymerase Chain Reaction)…………18
2.2.2  Sso-PDCD5序列與pET-21a載體限制酶剪切反應(Digestion)…    .……19
2.2.2.1 剪切反應實驗步驟……………………………………………..…...19
2.2.3 酵素去除反應(PCR Purification Kit)…………………………………..…19
2.2.4 目標基因與載體黏合反應(Ligation)…………………………………..…20
2.2.4.1 黏合反應實驗步驟……………………………………………..…...20
2.2.5 勝任細胞製備(Compent Cell)………………………………………..    …...20
2.2.6 轉化作用(Transformation)………………………………………..……….21
2.2.7 菌落聚合酶鏈鎖反應(Colony PCR)………………………………..…….21
2.2.8  DNA膠體-瓊脂糖凝膠電泳反應(Agarose gel electrophoresis)………...23
2.2.9定序檢測(Sequencing)………………………………………………...……24
2.3 Sso-PDCD5蛋白質生產(Protein Expression)…………………………………25
2.3.1 生產條件篩選(Time Course)……………………………..……………….25
2.3.2  SDS 蛋白質電泳分析…………………………………...    .……………..25
2.3.3 大量表現蛋白質……………………………………………………..……26
   2.4 Sso-PDCD5蛋白質純化(Protein Purificaion)………………………27
      2.4.1 超音波震盪破菌與離心……………………………..……………………27
2.4.2 耐熱性測試………………………………………………………………27 
2.4.3 管柱純化………………………………………………………………..    …27
2.4.3.1 親和性純化法 (Affinity chromatography, His-tag column)……..…..27
2.4.3.2膠體過濾法(Size-exclusion chromatography, Gel filtration)…...……..29
2.5 點突變(site-directed mutagenesis)…………………………………………….30
2.6 Seleno-L-methionine重原子置換法……………………………………………..32
2.7晶體條件篩選與X光照射上機……………………………………………….…34
2.7.1 預長晶實驗(Pre-crystallization Test)…………………    ……………34
2.7.2 機器篩選長晶條件…………………………………………….…………35
2.7.3 手動長晶…………………………………………………………..………35
2.7.4 X-ray繞射實驗…………………………………………...………………...36
2.8電腦軟體數據分析………………………………………………………...……..37
2.8.1 HKL2000…………………………………………………..……………….37
2.8.2 CCP4i……………………………………………………...………………..38
2.8.3 Coot……………………………………………………...………………….38
2.8.4 Pymol………………………………………………………...……………..38
2.9 Sso-PDCD5活性測試…………………………………………………………....39
2.9.1 蛋白質C端熒光光譜測量(Fluorescence Quenching)…..………………..39

第三章    結果…………………………………………………………………………40
3.1建構目標基因Sso-PDCD5序列在pET-21a載體……………………………….40
3.2勝任細胞與生長條件篩選(Time Course)………………………………………..43
3.3 Sso-PDCD5蛋白質可利用His-tag具有耐熱性…………………………….…..46
3.4 Sso-PDCD5 Wild type晶體條件篩選及上機………………………..……….…50
3.5 Sso-PDCD5點突變不影響蛋白質表現量……………………………………....51
3.6 重原子硒標記甲硫氨酸培養法………………………    …………………..…….55
3.7 Sso-PDCD5-L45M、SeMet-L45M晶體條件篩選與上機………………..…57
3.8 Tfar19、Mth1615與Sso-PDCD5結構差異比較………………………………...59
3.9 Sso-PDCD5的生理功能……………………………………………...………….62

第四章    討論與未來方向……………………………………………………….…64
4.1人類PDCD5與Sso-PDCD5路徑差別……………………………………….….64
4.2探討PDCD5在蛋白質結構學的方法…………………………………...………64
  4.2.1 X-ray跟NMR解結構……………………………………………………….64
  4.2.2啤酒酵母S. cerevisiae的Ymr074cp蛋白質…………………………….65
4.3 未來方向…………………………………………………………………..…….67
4.3.1蛋白質C端截斷測試C-terminal Truncation………………………….…..67
4.3.2 PCD作用相關蛋白研究…………………………………………………….68
參考文獻………………..……………………………………………………..…    ………72
附錄……………………………………………………………………………………...    .75











圖 目 錄
圖一、人類PDCD5的傳遞路徑...........................................................................................2
圖二、Tfar19與SsoPDCD5基因序列具有相似性……………………………..………...3
圖三、PCD路徑圖………………………………….……………………………………...4
圖四、Sulfolobus相關性古生菌及作者……………….…………………………………..6
圖五、長晶原理：蒸氣擴散法(座式)……………………………………...……………….8
圖六、布拉格定律示意圖…………………………………………………………………9
圖七、X-ray 繞射成像原理…………………………………………………………..….10
圖八、傅立葉轉換公式……………………………………………………………..……11
圖九、利用重原子異常散射找出相位角………………………………………………..12
圖十、實驗架構設計圖…………………………………………………………..………14
圖十一、11a. 依照pET-21a全基因序列圖上挑選限制酶切位………………………...16
圖十一、11b. 由Sso-0352序列設計前端引子和後端引子……………….....................16
圖十二、基因定序後，確認Sso-PDCD5序列中的第18個核苷酸由A變為T
……………………………………………………………………………………..    ……..18
圖十三、Sso-PDCD5基因建構於pET-21a載體過程..…………………………..……...21
圖十四、生產蛋白質流程圖……………………………………………………………..26
圖十五、粗萃蛋白質過程及耐熱性測試………………………………………………..27
圖十六、親和性管柱純化原理…………………………………………………………..28
圖十七、膠體過濾性管柱純化原理………………………………………….………….29
圖十八、18a.  Sso-PDCD5點突變位置……………………………………………..….30
圖十八、18b. 點突變實驗流程圖…………………………………………………...…..30
圖十九、19a. 清澈顆粒沉澱……………………………………………………………..35
圖十九、19b. 非典型重度晶體沉澱……………………………………………...……..35
圖二十、蒸氣擴散法(Vapor Diffusion)原理…………………………………………..…36
圖二十一、Sso-PDCD5序列從Genomic DNA釣出……………………………….……41
圖二十二、最終轉化作用的結果為Sso-PDCD5建構在pET-21a載體………………...41
圖二十三、利用NCBI Blast比對結果，Query Cover 99%原因為SSO-0352前端序列第18個胺基酸已從A變為T………………………………………………………...…..42
圖二十四、24a. 利用大腸桿菌BL21(DE3)做為勝任細胞所表現並無Sso-PDCD5蛋白質……………………………………………………………………………………    ……43
圖二十四、24b. 利用大腸桿菌Rosetta做為勝任細胞所表現稍量的Sso-PDCD5蛋白質……………………………………………………………………………………...    ….44
圖二十四、24c. 利用大腸桿菌RIL做為勝任細胞所表現為最多的Sso-PDCD5蛋白質決定使用大腸桿菌RIL、以IPTG誘導第三小時當做生產蛋白質條件…………..…44
圖二十五、耐熱性測試及緩衝液條件…………………………………………………..47
圖二十六、26a. FPLC peak(編碼24-32為Sso-PDCD5蛋白質) …………………….….48
圖二十六、 26b. SDS protein gel：將破菌後上清液以nickel-containing resin管柱純化，得出單一蛋白質Sso-PDCD5……………………………………………………...…….48
圖二十六、26c.經由Gel filtration(Size-exclusion chromatography)管柱後的訊號(編碼 20-29)得到皆為單體(monomer)的Sso-PDCD5蛋白質………………………………...49
圖二十七、27a. 為了驗證突變型L45M無改變表現量，做了條件篩選，結果依舊與原本的Sso-PDCD5表現量相似…………………………………………………………52
圖二十七、27b. L45M在His-trap colunm純化情形………….………………..………..52
圖二十七、27c. L45M與Sso-PDCD5 Full Length實際比較…………………….……..53
圖二十七、27d. 在Size-exclusion chromatography純化情形……………………..…....53
圖二十七、27e. 將L45M大量製備完，經過FPLC的Affinity chromatography 和Size-exclusion chromatography得到純度很高的L45M蛋白質…………………...…...54
圖二十八、28a. SeMet-L45M經由FPLC管柱His-Trap FF 5ml純化分離出單一的蛋白質………………………………………………………………………………    ………55
圖二十八、28b. 經由His-Trap FF 5ml親和性管柱後，收集SeMet-L45M蛋白質濃縮至500  μl，注入Superdex 200pg膠體大小管柱進行純化過程………………...……..56
圖二十九、29a Mth.1615、人類PDCD5（Tfar19）和Sso-PDCD5結構比較………….…60
圖二十九、29b.利用Clustal Omega網站做出序列比對，觀察其相似性………………60
圖三十、30a. 隨機Sulfolobus solfataricus的20 bp DNA………………………...……..62
圖三十、30b. 定量Sso-PDCD5 Protein以20 bp DNA滴定，使色胺酸（Tryptophan）在吸光值OD350下的吸光值逐漸降低…………………………………………………..62
圖三十、30c. 將28b.圖換算為加了多少濃度的DNA會使吸光值的強度趨近於平穩，得出當20 bp DNA到達25μM時，色胺酸（Tryptophan）於OD350吸光值的下降總量趨於接近1，代表20 bp DNA與Sso-PDCD5結合量達到飽和………………...............63
圖三十一、Ymr074cp蛋白質結構及胺基酸序列全覽圖……………………………….66
圖三十二、Methanothermobacter thermautotrophicus、Saccharomyces cerevisiae、Homo sapiens不同方向觀察之PDCD5序列中參與疏水基相互作用的氨基酸……………..70











表 目 錄
表一、1a. PCR反應所需材料及反應比例，將上述混好分裝置小型微量離心管(Mini eppendorf)送入機器……………………………………………………...………………17
表一、1b. 依照此溫度流程進行PCR反應…………………………………..………….17
表二、1a. Colony PCR反應所需材料及反應比例，將上述混好分裝置小型微量離心管(Mini eppendorf)送入機器…………………………………...………………………..22
表二、1b. 依照此溫度流程進行PCR反應……………………………..……………….23
表三、3a. TAE Buffer(50X)配法，稀釋至1倍後於 DNA膠體-瓊脂糖凝膠電泳反應中做為膠體和緩衝液使用…………………………………………..…………………..24
表三、3b. 6X DNA Sample loading dye配法，為DNA Sample的染劑………...…….....24
表四、預長晶濃度測試表………………………………………………………..………34
表五、機器篩選Sso-PDCD5-WT長晶條件，包括鹽類、沉澱劑、緩衝液…………...….50
表六、Sso-PDCD5 Wild type之X-ray詳細繞射數據…………………………………...51
表七、 機器篩選Sso-PDCD5-L45M長晶條件…………………………………...…….57
表八、突變型Sso-PDCD5-L45M之X-ray詳細繞射數據……………………………....58
表九、PDCD5在不同物種的同源蛋白質………………………………………….……67
表十、PCD作用相關蛋白別名與性質描述…………………………………….……….68

                                

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