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研究生： 謝志遠
HSIEH, CHIH-YUAN
論文名稱： 利用(UV-VIS-NIR)吸收光譜分析法快速量測水中大腸桿菌之研究
指導教授： 廖述良
口試委員:
學位類別： 碩士
Master
系所名稱： 工學院 - 環境工程研究所
Graduate Institute of Environmental Engineering
論文出版年： 2013
畢業學年度： 101
語文別： 中文
論文頁數： 76
中文關鍵詞： ONPG 、大腸桿菌 、吸收光譜
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    • 環境檢測法中大腸桿菌的檢測需要較長時間培養、估算結果，若水體為生活休閒用水或飲用水水體，人體將曝露在高致病風險裡，因此檢測時間是一大問題，雖然已有不同快速檢測法開始著手解決，但都具有成本高、操作複雜等缺點，因此，本研究將利用吸收光譜法，使用酵素反應基質ONPG與大腸桿菌反應，藉由反應產物鄰-硝基酚具有吸光作用建立由分光光度計量測大腸桿菌之方法，藉以改善現在檢測法中耗時的缺點，而本研究建立之量測方法，僅需要加入反應基質0.5mM即可在35分鐘內得到尚可之線性相關量測模式，經由實際量測生活休閒用水體，35分鐘內量測到大腸桿菌數與環境檢測法中之酵素濾膜法比較差異百分比最低至最高為20.01%~53.40%，在量測數量方面，最低至最高可量測數範圍由49,300,000(CFU/100ml)~247,800,000(CFU/100ml)，但在量測實際水體中，大腸桿菌可能因為有相同酵素之生物干擾而高估。

    The method of detection E. coli of environmental takes a long time to estimate the results, if water is a life of leisure or drinking, the human body will be exposed to a high risk of illness, and thus cause to detection time. Although there are different rapid detection method have issued, but all have high costs, complicated operation and other shortcomings, therefore, this study will use absorption spectrometry, using the E. coli enzyme reaction substrate ONPG reaction, the reaction product by o - nitrophenol with absorption spectrophotometer measured by the effect of establishing the method of E. coli in order to improve the current shortcomings of time-consuming assays, and the study established measurement methods, requiring only added to the substrate 0.5mM can get in 35 minutes the acceptable linear correlation measurement mode, by actual measurement life of leisure water, within 35 minutes, measured the number of E. coli and the environment in the enzyme assay of membrane filter percentage difference between the lowest to the highest was 20.01% ~ 53.40%, the measuring quantity, the minimum to the maximum number of measurements ranging from 49,300,000 (CFU/100ml) ~ 247,800,000 (CFU/100ml), but in the waste, sewage, E.coli may have the same enzymes as biological interference and overestimate.

    中文摘要 .....................................................iv 英文摘要 .....................................................v 目錄 ...................................................vi 表目錄 .....................................................x 第一章前言 ...............................................................................................................1 1.1 研究緣起.................................................................................................................1 1.2 研究目的.................................................................................................................2 第二章文獻回顧.......................................................................................................3 2.1 大腸桿菌檢測法現況..............................................................................................3 2.2 大腸桿菌檢測法之發展..........................................................................................5 2.3 光學與光譜原理......................................................................................................7 2.3.1 光學原理......................................................................................................7 2.3.2 光譜原理....................................................................................................10 2.3.3 吸收光譜原理.............................................................................................10 2.4 大腸桿菌吸收光譜法發展現況............................................................................14 第三章研究方法.....................................................................................................16 3.1 研究流程...............................................................................................................16 3.2 確認大腸桿菌吸光作用及吸收光譜資訊.............................................................18 3.2.1 大腸桿菌吸光作用、機制..........................................................................18 3.2.2 確認大腸桿菌之光譜資訊..........................................................................22 3.3 確認大腸桿菌與ONPG反應過程之干擾..............................................................26 3.3.1 確認基質ONPG之光譜資訊.......................................................................27 3.3.2 ONPG基質最佳加藥量...............................................................................28 3.3.3 ONPG使用限制...........................................................................................28 3.4 建立大腸桿菌量測方法........................................................................................30 3.4.1 量測鄰-硝基酚之吸收光譜........................................................................31 vii 3.4.2 大腸桿菌量測模式建立.............................................................................32 3.5 驗證大腸桿菌量測方法及量測極限.....................................................................33 第四章結果與討論..................................................................................................34 4.1 分光光度計儀器校正............................................................................................34 4.2 大腸桿菌吸光作用、機制及吸收光譜資訊探討..................................................37 4.2.1 大腸桿菌吸光作用、機制探討..................................................................374.2.2 大腸桿菌吸收光譜資訊之探討..................................................................404.2.3 小結............................................................................................................42 4.3 鄰-硝基酚之吸收光譜探討...................................................................................434.3.1 基質ONPG最佳加藥量探討.......................................................................464.3.2 大腸桿菌與ONPG反應過程干擾之探討....................................................48 4.3.3 小結............................................................................................................52 4.4 建立大腸桿菌量測方法結果探討.........................................................................52 4.4.1 鄰-硝基酚未離心、未加鹼之反應吸光度探討..........................................52 4.4.2 鄰-硝基酚未離心、加鹼之反應吸光度探討.............................................55 4.4.3 鄰-硝基酚離心、未加鹼之反應吸光度探討.............................................55 4.4.4 鄰-硝基酚離心、加鹼之反應吸光度探討.................................................62 4.4.5 鄰-硝基酚1小時內加鹼前、後之反應吸光度探討..................................62 4.4.6 小結............................................................................................................67 4.5 驗證大腸桿菌量測方法探討................................................................................67 4.5.1 多筆大腸桿菌驗證結果探討......................................................................67 4.5.2 實際水體驗證量測模式探討......................................................................69 4.5.3 小結............................................................................................................71 4.6 量測水中大腸桿菌之方法....................................................................................71 第五章結論與建議..................................................................................................72 5.1 結論.......................................................................................................................72 5.2 建議.......................................................................................................................73 參考文獻...................................................................................................................74 viii 圖目錄 圖2-1 光譜的種類 ...................................................................................................10 圖2-2 吸收光譜定量分析圖 ....................................................................................12 圖2-3 ONPG與酵素β-galactosidase反應水解示意圖 ............................................15 圖3-1 研究流程圖 ...................................................................................................17 圖3-2 大腸桿菌原液製備流程圖 ............................................................................19 圖3-3 離心機分離大腸桿菌流程圖 ........................................................................20 圖3-4 量測大腸桿菌吸光作用流程圖 ....................................................................21 圖3-5 大腸桿菌特徵吸收波長分析流程 ................................................................23 圖3-6 水在室溫下波長190-1100nm之吸光值 ......................................................29 圖3-7 建立大腸桿菌量測方法流程圖 ....................................................................30 圖4-1 儀器雜訊光譜圖............................................................................................35 圖4-2 乙醇光譜圖 ...................................................................................................36 圖4-3 E.coli (10μl)菌液過濾前後吸收光譜圖 ...........................................................38 圖4-4 E.coli (20μl)菌液過濾前後吸收光譜圖 ...........................................................38 圖4-5 E.coli (30μl)菌液過濾前後吸收光譜圖 ...........................................................39 圖4-6 E.coli (40μl)菌液過濾前後吸收光譜圖 ...........................................................39 圖4-7 E.coli (50μl)菌液過濾前後吸收光譜圖 ...........................................................40 圖4-8 不同濃度大腸桿菌之吸收光譜 ....................................................................41 圖4-9 不同濃度ONPG之吸收光譜 ........................................................................43 圖4-10 不同濃度鄰-硝基酚之吸收光譜 .................................................................44 圖4-11 不同濃度鄰-硝基酚加Na2CO3後之吸收光譜 ............................................44 圖4-12 ONPG與加鹼後鄰-硝基酚相同濃度比較圖 ................................................45 圖4-13 ONPG與大腸桿菌100μl反應20min結果 ..................................................47 圖4-14 ONPG與大腸桿菌100μl反應40min結果 ..................................................47 圖4-15 ONPG與大腸桿菌100μl反應60min結果 ..................................................48 圖4-16 水在不同溫度之吸收光譜 ..........................................................................49 ix 圖4-17 水在波長970nm處隨溫度相關圖 .............................................................49 圖4-18 水在波長1034nm處隨溫度相關圖 ...........................................................50 圖4-19 ONPG0.1mM未水解前加Na2CO3測試圖 ....................................................51 圖4-20 ONPG0.5mM已水解加Na2CO3測試圖 ........................................................51 圖4-21 水樣A反應第9小時離心前、後比較圖...................................................57 圖4-22 水樣E反應第9小時離心前、後比較圖 ...................................................57 圖4-23 不同大腸桿菌數反應35分鐘後與產物鄰-硝基酚吸光度相關性(420nm)68 圖4-24 不同大腸桿菌數反應35分鐘後與產物鄰-硝基酚吸光度相關性(380nm)68 x 表目錄 表2-1 用於檢測與計數大腸桿菌與大腸桿菌群之方法 ...........................................4 表2-2 目前大腸桿菌快速檢測法之發展 ..................................................................7 表2-3 可見光波長範圍及其互補色表 ....................................................................14 表2-4 酵素反應吸收光譜發展現況 ........................................................................15 表4-1 不同水樣之大腸桿菌數 ................................................................................41 表4-2 不同水樣與大腸桿菌數之多元迴歸結果 .....................................................41 表4-3 鄰-硝基酚不同濃度線性迴歸相關性(加Na2CO3後) ....................................45 表4-4 未離心未加鹼之鄰-硝基酚吸光度與大腸桿菌數相關性(420nm) ...............53 表4-5 未離心未加鹼之鄰-硝基酚吸光度與大腸桿菌數相關性(380nm) ...............54 表4-6 未離心加鹼之鄰-硝基酚吸光度與大腸桿菌數相關性(420nm) ...................58 表4-7 未離心加鹼之鄰-硝基酚吸光度與大腸桿菌數相關性(380nm) ...................59 表4-8 離心未加鹼之鄰-硝基酚吸光度與大腸桿菌數相關性(420nm) ...................60 表4-9 離心未加鹼之鄰-硝基酚吸光度與大腸桿菌數相關性(380nm) ...................61 表4-10 離心加鹼之鄰-硝基酚吸光度與大腸桿菌數相關性(420nm) .....................63 表4-11 離心加鹼之鄰-硝基酚吸光度與大腸桿菌數相關性(380nm) .....................64 表4-12 鄰-硝基酚1小時內加鹼前之反應吸光度與大腸桿菌數相關性(420nm) .65 表4-13 鄰-硝基酚1小時內加鹼前之反應吸光度與大腸桿菌數相關性(380nm) .65 表4-14 鄰-硝基酚1小時內加鹼後之反應吸光度與大腸桿菌數相關性(420nm) .66 表4-15 鄰-硝基酚1小時內加鹼後之反應吸光度與大腸桿菌數相關性(380nm) .66 表4-16 廢水ONPG反應35分鐘後之吸光度與實際大腸桿菌數(420nm).............70 表4-17 廢水ONPG反應35分鐘後之吸光度與實際大腸桿菌數(380nm).............70 表4-18 廢水推估大腸桿菌數結果(420nm) .............................................................70 表4-19 廢水推估大腸桿菌數結果(380nm) .............................................................70

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