探討麩胺酸的添加對於液態發酵生產松杉靈芝菌多醣體和靈芝酸之研究

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研究生：	沈雍智 Shen-Yung Jr
論文名稱：	探討麩胺酸的添加對於液態發酵生產松杉靈芝菌多醣體和靈芝酸之研究
指導教授：	徐敬衡 Hsu-Jing Heng
口試委員:
學位類別：	碩士 Master
系所名稱：	工學院 - 化學工程與材料工程學系 Department of Chemical & Materials Engineering
畢業學年度：	93
語文別：	中文
論文頁數：	110
中文關鍵詞：	多醣體、松杉靈芝、麩胺酸、靈芝酸
外文關鍵詞：	glutamate, polysaccharide, ganoderic acid, Ganoderma tsugae
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摘要
松杉靈芝菌為食藥用菇中的一種，食藥用菇最吸引人的地方在其抗癌、抗腫瘤的效果，而松杉靈芝菌於液態葡萄糖培養基培養時產生的胞外多醣，主要的成份為β-1-3/β-1-6 glucan，經學者確認此結構具有抗癌、抗腫瘤療效，而且經動物與人體試驗證實能有效地提高其免疫機能，活化體內巨噬細胞的吞噬能力，而且松杉靈芝菌多醣可開發為醫藥治療用途，用於幫助增強病人的免疫系統和抵抗腫瘤的能力而且靈芝含有特殊三萜類（特稱為「靈芝酸」），為其他植物所沒有，靈芝中所含三萜類的主要功能為：抑制癌細胞生長、抑制組織胺釋放，防止過敏、促進肝功能、促進血小板凝集、以及降血脂，防中老年人發生心血管方面的疾病，因此具有相當潛力被開發為未來醫療用品，或作為近年來國內相當熱門的保健食品，視為未來的明星產品。
為了有效增加松杉靈芝菌多醣的靈芝酸產量，並縮短生產的時間，本研究將利用液態深層發酵來培養生產松杉靈芝菌多醣，採用的菌株為松杉靈芝菌Ganoderma tsugae ATCC 46754，其中影響發酵過程的因素很多，本研究將針對培養基的改變，探討對松杉靈芝菌生產的影響。據文獻指出，麩胺酸能有效幫助一些微生物於生產過程中提供能量以利於菌體生長和促進多醣生成的增加，因此實驗中選擇添加麩胺酸來探討其對於松杉靈芝菌菌體生長、多醣和靈芝酸生成的影響。
在搖瓶實驗中發現，添加麩胺酸有助於多醣產量的增加與轉化率的提升，但是對於靈芝酸的產量提升不明顯，且轉化率還有抑制情形的產生，在菌體濃度方面則因為添加過高濃度的麩胺酸(0.5%)，而有抑制菌體生長的現象發生，而搖瓶處於缺氧的狀態下培養，多醣產量低於發酵槽環境，顯示缺氧的狀態下不利於菌體刺激更多的多醣生成。
在發酵槽實驗結果顯示，隨著麩胺酸添加會增加菌體量的產生從3.21增加到4.53g/L，但是並不會影響菌體比生長速率(µ)；在多醣生成方面，添加麩胺酸有利於松杉靈芝菌多醣的產量增加，濃度從0～5 g/L，最大的多醣產量由0.56明顯提升至1.03g/L，成長一倍，而轉化率的部份也是有相同的趨勢，Yp/s由0.134增加至0.196，Yp/x也由0.181增加至0.267，對於靈芝酸產量方面雖然有從56增進81 mg/L，但是轉化率的部份卻是呈現抑制的情形，Yp/s由0.012減少至0.009，Yp/x也由0.019減少至0.012，顯示添加麩胺酸會使得松杉靈芝改變其代謝途徑，刺激多醣體的生成，減少靈芝酸的生成。
從多醣分子量分布圖的結果來看，松杉靈芝菌發酵液中多醣體分子量分布主要出現在8.5~8.9分鐘和5.2~5.4分鐘，此滯留時間之平均分子量約為70kDa和1400kDa。由分子量分布情形瞭解，高分子量區域百分比隨麩胺酸濃度添加而呈現遞增情形，還有發現過了恆生長期高分子量區域百分比會降低，中低分子量區域百分比隨之上升，推測應為高活性的水解酵素分解多醣體造成。同時我們也發現添加麩胺酸使得β1-3 glucan濃度呈現遞增情形，代表添加麩胺酸不但對於總多醣的濃度有明顯增加，同時β1-3 glucan濃度也提升了1.4倍，代表不但是多醣的量有所增加，連多醣的質也大幅改善。

目  錄
摘要………………………………………………………….……………I
目錄……………………………………………………………..………IV
表索引…………………………………………………………….......VIII
圖索引……………………………………………………………...…...IX
第一章 緒論…………………………………………….…………….…1
1-1研究背景………………………………………………………...1
1-2研究目的………………………………………………………...2
第二章 文獻回顧………………………………………………………..3
2-1真菌菇類的介紹........………………………………...........3
2-2靈芝的分類與研究……………………………..………………3
2-2-1靈芝屬的分佈…………………………………………………5
2-2-2靈芝屬的形態特徵……………………………………………5
2-2-3靈芝屬的生長發育…………………………………………...6
2-2-4靈芝屬的成份…………………………………………….......7
2-2-5靈芝屬的藥效………………………………………………...9
2-3真菌多醣的介紹………………………………….....................11
2-3-1真菌多醣的特性…………………………………………….12
2-3-2β-D-葡聚糖的抗腫瘤機制與免疫功能…………..………..16
2-3-3真菌多醣的結構…………………………..………………....17
2-4真菌三萜類的介紹…………………...………………………..20
2-4-1合成萜類的單體…………………………………………….20
2-4-2萜類的重要性質…………………………………………….21
2-4-3三萜的合成機制…………………………………………….21
2-4-4菇類三萜的基本結構………………………………...……..24
2-5深層發酵培養……………………………..…………………...29
2-5-1何謂深層發酵培養………………………………………….29
2-5-2深層發酵培養的優點……………………………………….29
2-6影響發酵的物理化學因子………………………………...….29
2-6-1物理因子…………………………………………………….30
2-6-2化學因子…………………………………………………….34
2-7麩胺酸的介紹與效應…………………………………………39
2-7-1麩胺酸的簡介……………………………………………….39
2-7-2麩胺酸的應用………………….……………………………41
2-7-3麩胺酸的效應……………………………………………….44
第三章 實驗材料與方法…………..………………………………..46
3-1實驗材料…………………………………………………...…46
3-1-1實驗菌株……………………………………………………46
3-1-2培養基組成……………………………………….…………46
3-1-3實驗藥品…………………………………………………….46
3-1-4實驗儀器與設備……….……………………………………48
3-2實驗方法………………………………………………………50
3-2-1菌種的保存方法與接種活化…..………………….………..50
3-2-2搖瓶實驗…………………………………………….………51
3-2-3發酵槽實驗……………………………………………….…51
3-3分析方法………………………………………………………51
3-3-1取樣………………………………………………………….52
3-3-2 分離菌絲體及發酵液(Broth)……………………………....53
3-3-3酸鹼值測定(pH)…………………………………………….54
3-3-4溶氧值測定(DO)…………………………………………….54
3-3-5菌體乾重測定(Biomass，X)………………………………..54
3-3-6還原糖濃度測定(Glucose，S)…………………………..…..54
3-3-7麩胺酸殘餘濃度分析……………………………………….54
3-3-8酚硫酸測定法…………………..………………………..….55
3-3-9多醣體分子量分析……………………………………….…55
3-3-10螢光結構活性測定法……………………...………………56
3-3-11靈芝酸分析法…………………………………………...…57
3-3-12透析………………………………………………………..58
第四章 結果與討論…………..………………………………59
4-1松杉靈芝菌平面培養菌絲型態………………………………59
4-2搖瓶培養實驗…………………………..……………….…….59
4-2-1麩胺酸濃度的效應……………………………………….…59
4-2-2不加入葡萄糖僅添加麩胺酸濃度的效應………………….66
4-3【發酵槽培養實驗】麩胺酸濃度的效應………………….….67
4-3-1【胞外多醣】發酵動力曲線的比較………………….…….67
4-3-2麩胺酸濃度對菌體生長的影響…………………………….70
4-3-3麩胺酸濃度對多醣生成的影響………………………….…71
4-3-4麩胺酸濃度對多醣分子量分布的影響…………………….72
4-3-5麩胺酸濃度對β1-3 glucan濃度的影響…………………...78
4-3-6【靈芝酸】發酵動力曲線的比較…………………………..80
4-3-7麩胺酸濃度對靈芝酸生成的影響………………………….82
第五章 結論與建議……………………………………………..…..85
5-1結論………………………………………………………..…...85
5-2建議…………………………………………………………….87
參考文獻………………………………..………………………………88
附錄……………………………...……………………………………...93

                                

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