嗜酸熱硫化葉菌的DNA結合蛋白Saci_0101之結構與功能分析

簡易檢索 / 詳目顯示

回結果列表

研究生：	謝東霖 Dong-Lin Hsieh
論文名稱：	嗜酸熱硫化葉菌的DNA結合蛋白Saci_0101之結構與功能分析 Structural and Functional Analysis of the DNA Binding Protein Saci_0101 from the Hyperthermophile Sulfolobus acidocaldarius
指導教授：	陳青諭 Chin-Yu Chen
口試委員:
學位類別：	碩士 Master
系所名稱：	生醫理工學院 - 生命科學系 Department of Life Science
論文出版年：	2016
畢業學年度：	104
語文別：	中文
論文頁數：	58
中文關鍵詞：	嗜酸熱硫化葉菌、DNA結合蛋白、DNA纏繞
外文關鍵詞：	histone-like protein, Saci_0101, DNA packing
相關次數：	點閱：8 下載：0
分享至:	分享至facebook 分享至twitter

查詢本校圖書館目錄查詢臺灣博碩士論文知識加值系統勘誤回報

細胞內的DNA需要被蛋白質纏繞，有效地縮小尺寸以便儲存於細胞內，而古生菌分為兩類，一類是似真核生物利用相仿組織蛋白的方式形成四聚體的核小體；另一類則是似原核生物，比如在古生菌硫化葉菌屬胞內，由一群分子量7-10 KDa的染色質蛋白質(Sul10a, Sul10b, Sul7d, Sul7c)，將DNA纏繞形成緊密結構。蛋白質Saci_0101通常認為是參與DNA纏繞保存的蛋白質，在此篇研究中，我們解析出了蛋白質Saci_0101兩種不同晶格的結構，解析度分別為1.30 Å和1.40 Å。從結構中可以看出，蛋白質Saci_0101與其在硫磺礦硫化葉菌中同源蛋白Sso7c4之結構相當相似，都藉由-loop-相互交聯形成二聚體的構型，而進行點突變之Saci_0101 I20M也得到解析度1.55 Å的結構，有趣的是，經過點突變之後發現到與野生型的Saci_0101相比，Saci_0101 I20M的1 helix相對較短，B-factor數值也降低至僅有14，可以明顯看出突變過後的動態特性明顯降低。在偏極化螢光分析的實驗中，發現到Saci_0101與雙股DNA的結合力為1.23  0.19 M，這與其他古生菌硫化葉菌屬的其他非特異性的雙鏈DNA結合蛋白相當接近。而利用電子顯微鏡(Electron Microscope)觀察蛋白質與DNA結合機制後，也證明了Saci_0101可以使DNA纏繞，並且具有架橋的功能。

Saci_0101 is commonly believed to be a histone-like protein involved in genomic DNA compaction from Sulfolobus acidocaldarius. Here, to obtain a detailed understanding of its architectural properties, we present two crystal structures of wild type Saci_0101 in different crystal forms at 1.30 Å and 1.40 Å resolution, respectively. The overall crystal structures of both wild type are similar with the homologues of Sso7c4 in S. solfataricus and have a homodimeric DNA-binding fold forming a swapped -loop- ‘Ying-Yang’ topology. The crystal structure of its single mutant, I20M also has been solved at 1.55 Å resolution. Interestingly, the single mutation by replacing Ile with Met leads to the shortening of 1 helix and even makes the mutant structure much more static than the wild type, proved by the very small B-factor of 14 in I20M structure. In fluorescence polarization study, wild type Saci_0101 binds to a 20-bp double-stranded DNA with a binding affinity of 1.23 ± 0.19 M, which is close to other nonspecific dsDNA-binding proteins in Sulfolobus species. The EM studies show Saci_0101 may shape DNA as a wrapper and a briddger, which suggests Saci_0101 play a role in DNA packaging and duplex stabilization at the elevated growth temperatures.

目        錄
中文摘要                                                              i
Abstract                                                              ii
致謝                                                                  iii
目錄                                                                  iv
圖目錄                                                              vii
表目錄                                                              viii
縮寫檢索表                                                          ix
第一章    緒論                                                          1
1-1    菌種                                                          1
    1-1-1古細菌域                                                  1
    1-1-2古生菌硫化葉菌屬                                          2
1-2    DNA結合蛋白                                                  3
    1-2-1古細菌中的DNA結合蛋白                                  3
    1-2-2蛋白質Sso7c4和蛋白質Saci_0101                          3
    1-2-3 DNA結合蛋白質的構築功能                                  5
1-3    研究動機                                                      6
第二章    材料與方法                                                  7
2-1    建構目標蛋白質基因與載體                                      7
2-1-1    嗜酸熱硫化葉菌之菌株培養與全基因體萃取                  7
        2-1-2    聚合酶鏈鎖反應引子（PCR Primer）設計                  9
        2-1-3    聚合酶鏈鎖反應擴增目標基因                              10
        2-1-4    利用膠體電泳確認目標基因片段                          11
2-1-5    純化基因片段                                          12
        2-1-6    剪切反應（Digestion）                                 12
        2-1-7    接合反應（Ligation）                                 12
        2-1-8    轉型作用（Transformation）                             13
        2-1-9    基因定序                                              13
 
2-2    目標蛋白質之大量表現                                          15
        2-2-1    測試最佳蛋白質表現條件                                  15
        2-2-2    聚丙烯醯胺膠體電泳                                      15
        2-2-3    大量表現蛋白質                                          16
    2-3    目標蛋白質之純化                                              17
        2-3-1    超音波震盪破菌                                          17
        2-3-2    加熱純化                                              17
        2-3-3    利用快速蛋白質液相層析儀純化蛋白質                      17
        2-3-4    冷凍乾燥                                              18
    2-4    利用X-ray晶體繞射技術解析蛋白質之結構                          19
        2-4-1    預結晶試驗（Pre-Crystallization Test）                 19
        2-4-2    蛋白質結晶條件篩選                                      20
        2-4-3    收集繞射數據                                          20
        2-4-4    解決相位問題                                          21
        2-4-5    結構的建立與優化                                      22
    2-5    點突變（Site-Directed Mutagenesis）                             23
        2-5-1    點突變I20M                                              23
        2-5-2    利用溶解度觀察蛋白質動態                              24
    2-6    蛋白質與DNA作用機制分析                                      25
        2-6-1    偏極化螢光分析                                          25
        2-6-2    利用電子顯微技術觀察蛋白質與DNA結合機制              25
第三章    結果                                                          26
    3-1    建構目標蛋白質基因與載體                                      26
    3-2    蛋白質表現條件測試                                              27
    3-3    測試蛋白質耐熱特性                                              28
    3-4    利用陽離子交換樹脂層析純化蛋白質                              29
    3-5    預結晶試驗                                                      31
    3-6    蛋白質結晶條件篩選                                              32
    3-7    蛋白質Saci_0101與點突變Saci_0101 I20M之結構描述              33
    3-8    偏極化螢光分析                                                  36
    3-9    利用電子顯微技術觀察蛋白質與DNA結合機制                      37
第四章    討論                                                          39
    4-1    蛋白質Saci_0101結構                                          39
    4-2    點突變Saci_0101 I20M影響蛋白質動態                          40
    4-3    偏極化螢光DNA結合力分析                                      41
    4-4    蛋白質與DNA結合機制                                          42
參考文獻                                                              43

                                

1. Q. She et al., The complete genome of the crenarchaeon Sulfolobus solfataricus P2. Proc Natl Acad Sci U S A 98, 7835-7840 (2001).
2. L. Chen et al., The genome of Sulfolobus acidocaldarius, a model organism of the Crenarchaeota. J Bacteriol 187, 4992-4999 (2005).
3. Y. G. Gao et al., The crystal structure of the hyperthermophile chromosomal protein Sso7d bound to DNA. Nat Struct Biol 5, 782-786 (1998).
4. P. Agback, H. Baumann, S. Knapp, R. Ladenstein, T. Hard, Architecture of nonspecific protein-DNA interactions in the Sso7d-DNA complex. Nat Struct Biol 5, 579-584 (1998).
5. B. N. Wardleworth, R. J. Russell, S. D. Bell, G. L. Taylor, M. F. White, Structure of Alba: an archaeal chromatin protein modulated by acetylation. EMBO J 21, 4654-4662 (2002).
6. C. H. Hsu, A. H. Wang, The DNA-recognition fold of Sso7c4 suggests a new member of SpoVT-AbrB superfamily from archaea. Nucleic Acids Res 39, 6764-6774 (2011).
7. M. S. Luijsterburg, M. F. White, R. van Driel, R. T. Dame, The major architects of chromatin: architectural proteins in bacteria, archaea and eukaryotes. Crit Rev Biochem Mol Biol 43, 393-418 (2008).
8. K. Nightingale, S. Dimitrov, R. Reeves, A. P. Wolffe, Evidence for a shared structural role for HMG1 and linker histones B4 and H1 in organizing chromatin. EMBO J 15, 548-561 (1996).
9. K. K. Swinger, P. A. Rice, IHF and HU: flexible architects of bent DNA. Curr Opin Struct Biol 14, 28-35 (2004).
10. R. Schneider et al., An architectural role of the Escherichia coli chromatin protein FIS in organising DNA. Nucleic Acids Res 29, 5107-5114 (2001).
11. S. Rimsky, Structure of the histone-like protein H-NS and its role in regulation and genome superstructure. Curr Opin Microbiol 7, 109-114 (2004).
12. Z. Otwinowski, W. Minor, Processing of X-ray diffraction data collected in oscillation mode. Method Enzymol 276, 307-326 (1997).
13. M. D. Winn et al., Overview of the CCP4 suite and current developments. Acta Crystallogr D 67, 235-242 (2011).
14. G. Langer, S. X. Cohen, V. S. Lamzin, A. Perrakis, Automated macromolecular model building for X-ray crystallography using ARP/wARP version 7. Nat Protoc 3, 1171-1179 (2008).
15. P. Emsley, B. Lohkamp, W. G. Scott, K. Cowtan, Features and development of Coot. Acta Crystallogr D 66, 486-501 (2010).
16. G. N. Murshudov et al., REFMAC5 for the refinement of macromolecular crystal structures. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 67, 355-367 (2011).
17. A. M. Rossi, C. W. Taylor, Analysis of protein-ligand interactions by fluorescence polarization. Nat Protoc 6, 365-387 (2011).
18. J. D. Griffith, G. Christiansen, Electron microscope visualization of chromatin and other DNA-protein complexes. Annu Rev Biophys Bioeng 7, 19-35 (1978).
19. S. M. Hartig, Basic image analysis and manipulation in ImageJ. Curr Protoc Mol Biol Chapter 14, Unit14 15 (2013).

簡易檢索 / 詳目顯示

相關論文