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研究生： 林蘭君
Lan-Chun Lin
論文名稱： 探討NaCl對於Streptomyces toxytrini發酵生產脂肪抑制劑Lipstatin的影響
指導教授： 徐敬衡
Chin-Hang Shu
口試委員:
學位類別： 碩士
Master
系所名稱： 工學院 - 化學工程與材料工程學系
Department of Chemical & Materials Engineering
畢業學年度： 93
語文別： 中文
論文頁數： 78
中文關鍵詞： 氯化鈉 、羅氏纖 、酵素動力學 、分光光度計 、脂肪抑制劑 、放線菌
外文關鍵詞： lipase inhibitor, NaCl, Streptomyces toxytricini, Orlistat, Lipstatin
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    • 近年來，肥胖已是大多數人所關心的話題，因為肥胖引起的併發症如心血管疾病、高血壓等都足以致死，從美國癌症預防第二期研究的數據分析，超過30萬名不吸煙且沒有心臟病史的成人，無論男女在14年間的心血管疾病死亡率隨BMI的增加而成長( BMI為體脂肪指數)，肥胖者死於心血管疾病的機率是最瘦的女性們的四倍，過量攝取食物中的脂肪是導致肥胖的主要原因，但多數肥胖者無法長期控制飲食及行為的方法成功減重，因此藥物的幫助就更顯重要。
    Orlistat(羅氏纖)是1981年羅氏大藥廠 (Roche) 科學家從真菌及細菌中尋找可用於控制體重的藥物，發現一株名為Streptomyces toxytricini的放線菌發酵後的發酵液分離純化後的衍生物有著高度抑制腸胃道脂肪的成分，並且對於因肥胖所導致的心血管疾病有著相當的療效。
    產物Lipstatin是Orlistat氫化前的前趨物，由於活性較高，因此羅氏大藥廠選擇活性較低但穩定性較高的Orlistat在市場上銷售，而我們的實驗是針對未氫化前的lipstatin做研究。
    第一個實驗是定性分析，先將我們經由Streptomyces toxytricini發酵得到的發酵液分離纯化後得到產物Lipstatin，利用HPLC、LC/MS的鑑定，確認我們的生產過程是正確的，並可產出我們所要的產物。
    文獻指出，Lipstatin從發酵液纯化的過程必須經過分離、兩次矽膠管柱層析與一次C18的管柱層析才能完成，之後才能將純化過後的Lipstatin以HPLC定量，過程繁複且費時，因此我們利用Lipstatin抑制酵素的性質發展出酵素法，將定量的方法簡化。
    另外文獻指出生產1.77g的Lipstatin需要41kg的菌絲體來作純化，由此可知產量很低，因此提高產量也是實驗的重點，在實驗中發現菌種對於添加適當濃度的NaCl對於菌體與產物的產量皆有幫助，在添加5 g/l NaCl時，菌體轉化率有最大值Yx/s=0.298；而在產物方面，添加15 g/l 之NaCl為最佳，產物轉化率可達到Yp/s=12.343。

    目 錄 ………………………………………………………………………頁數 摘 要………………………………………………………………I 目 錄………………………………………………………………III 圖索引………………………………………………………………VI 表索引………………………………………………………………X 第一章 緒論 1.1 研究動機…………………………………………………1 1.2 研究目的…………………………………………………3 第二章 文獻回顧 2.1 Streptomycs toxytricini 的介紹 …………………………4 2.1.1 放線菌(Actinomycetes)……………………………4 2.1.2 鏈黴菌( Streptomyces) ……………………………5 2.2 Orlistat 的介紹……………………………………………7 2.2.1 Orlistat的功能 ……………………………………8 2.2.2 Orlistat的結構 ……………………………………8 2.2.3 Orlistat的作用機制………………………………10 2.2.4 Orlistat的副作用…………………………………11 2.3 控制Lipstatin 產量和活性的最適條件 ………………12 2.3.1培養基對Lipstatin 產量的影響…………………12 2.3.2培養時間對Lipstatin 產量的影響………………13 2.3.3 pH值對Lipstatin活性的影響 …………………15 2.4 Lipstatin的純化與分析方法……………………………15 2.4.1 分離方法………………………………………15 2.4.2 純化方法………………………………………15 2.4.3 定性分析方法…………………………………16 2.5 酵素活性分析與動力學……………………………...17 2.5.1 酵素活性分析方法……………………………17 2.5.2 酵素動力學……………………………………20 2.5.3 酵素抑制劑……………………………………26 2.6 NaCl添加對於菌種的影響 …………………………32 第三章 實驗歸劃 ……………………………………………………35 第四章 實驗材料與方法 ……………………………………………37 4.1 菌種、培養基、試藥……………………………………37 4.1.1 菌種來源…………………………………………37 4.1.2 本研究所使用之藥品……………………………37 4.1.3 實驗設備與規格…………………………………39 4.1.4 實驗裝置…………………………………………40 4.2 實驗方法…………………………………………………42 4.2.1 菌種的保存與活化………………………………42 4.2.2 菌種培養…………………………………………42 4.2.3 分析方法…………………………………………45 4.2.4 酵素動力學………………………………………49 4.2.5 用酵素法測量產物Lipstatin ……………………50 4.3 發酵操作之實驗方法……………………………………51 4.3.1 針對培養不同時間作搖瓶發酵實驗……………51 4.3.2添加不同濃度之NaCl的發酵操作方法 ………51 第五章 結果與討論 …………………………………………………52 5.1 確認菌種培養的正確性…………………………………52 5.1.1 各種培養之觀察…………………………………52 5.1.2 菌種的生長曲線…………………………………56 5.2 確認產物的正確性………………………………………57 5.3 酵素動力學………………………………………………62 5.4 發酵動力學-添加不同NaCl濃度對於菌體與產物的影響…………………………………………………………65 5.4.1氣舉式發酵槽發酵動力曲線的探討 ……………65 5.4.2 發酵結果討論……………………………………70 第六章 結論 …………………………………………………………72 第七章 未來展望 ……………………………………………………73 第八章 參考文獻 ……………………………………………………74

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